正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GOGAT 广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。GOGAT 分为以 NADH 为还原剂的 NADH-GOGAT  和以铁氧还蛋白为还原剂的Fd-GOGAT。Fd-GOGAT  主要存在于叶绿体基质中，与光合作用和光呼吸有关，主要同化NO₃^- 还原和光呼吸产生的 NH₄⁺ 。

测定原理：

Fd-GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸，谷氨酸脱氢酶催化谷氨酸的脱氢反应，同时产生 NADH，使 WST-8 显橙黄色，在 450 nm 下测定吸光值。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 12mL 试剂六溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂二：液体 6mL×1瓶，4℃避光保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 5mL 蒸馏水溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入 20mL 试剂六溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；

试剂五：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存； 试剂六：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。

2、 样本测定

在 EP 管中加入如下试剂

3、 工作液配制

临用前按试剂四：试剂五=180:20(μL)的比例配制工作液，用多少配多少。

4、 谷氨酸含量测定

在 96 孔板中加入如下试剂

混匀，25℃反应 30min，450nm 下测定吸光值 A 测定与对照，△A=A 测定-A 对照，每个测定管设一个对照管。

标准曲线为 y = 2.2168x - 0.0005，R2 = 0.9996；其中 x 为标准品浓度 μmol/mL, y 为吸光值△A。

1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。

Fd-GOGAT(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0005)÷ 2.2168×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×1000=75.2×(ΔA+0.0005)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。

Fd-GOGAT(nmol/min/g  鲜重)=(ΔA+0.0005)÷ 2.2168×V 反总÷(W× V 样÷V 样总) ÷T×1000=75.2×(ΔA+0.0005)÷W

V 反总：反应体系总体积，0.25mL；ε：V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取 液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1000，μmol 到 nmol 的换算系数。