1、侧流免疫层析检测技术

    侧流免疫层析检测技术(LFIA) 也称横向流动免疫检测技术，是出现于20世纪60年代初期的一种独特的免疫分析方式，以条状纤维层析材料为固相，借助毛细管的吸附作用使样品在层析材料上移动，其中样品中的待测物与层析材料上一定区域的抗体结合，通过酶促显色反应或直接使用着色标记物短时间获得直观的测试结果。

    侧流免疫层析技术是一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法，主要用于病原体，激素，药物和代谢物等的检测，原理是通过标记抗原或抗体来识别待检物。侧流免疫层析试纸条主要包括样品垫、结合垫、层析膜、吸收垫、背衬及应用于试纸条上的各种试剂。根据待检测物分子的大小不同分为两种主要类型：双抗体夹心法和竞争法。

    1.1 双抗体夹心法

    双抗体夹心实验法是利用捕获抗体和检测抗体进行测定。一般用于检测大分子量的抗体、抗原类物质。大分子量分析物包含有两个或两个以上的结合位点，结合垫为着色标记物与待测抗原的特异性抗体(Ab1) 的偶联物，检测线为待测抗原的另一表位特异性抗(Ab2) ，质控线为抗Ab1抗体(Ab3) 。当待测样品中含有一定量的抗原时，样品通过层析作用到达结合垫位置，抗原和Ab1发生反应，与检测线的抗体形成双抗体夹心复合物，达到一定量后，通过沉积的标记物显示待检物的量。残留的抗体继续泳动到质控线位置，与Ab3反应而显色，得到阳性结果，见图1。样品中不含抗原，标记物和检测线抗体不发生反应，而质控线显色，得到了阴性结果。检测线和质控线均不显色时，表示试纸条无效。

    1.2 竞争法

    小分子量分析物只有一个抗体结合位点，使用竞争免疫试验进行检测。竞争法有两种类型，一种是检测区固化的是待测抗原或待测抗原的类似物。结合垫上为着色标记物与待测抗原的特异性抗体(Ab1) 的偶联物。当样品中含有待测抗原，样品待检测抗原与Ab1结合，由于竞争抑制作用，检测线处抗原不再发生反应，检测线处不显色，随后，抗原抗体复合物与抗Ab1抗体Ab2相结合，在质控线处显色，如图2。反之，随着抗原浓度的显色加深。另一种在检测区固化的是待测抗原的特异性抗体(Ab1) 。结合垫上为着色标记物和待测抗原或待测抗原类似物偶联物。通过样品中抗原和抗原偶联标记物竞争结合检测线上抗体，达到检测的目的。

图1 双抗夹心法原理示意图	图2 竞争法原理示意图

    2、侧流免疫层析技术在真菌毒素检测中的应用

    侧流免疫层析是一种将免疫技术、色谱层析技术和免疫标记技术相结合的固相膜免疫分析方法，这种层析技术常常是借助外来的标记物获得可测量的信号来分析结果。因此，有必要寻求一种高灵敏的免疫标记物，建立准确、快速、简便的真菌毒素检测方法。

    纳米粒子一般是指颗粒尺寸在1～100nm 范围内的超微粒子。它具有表面效应、小尺寸效应、量子效应、宏观量子隧道效应等特性。与正常粒子相比，纳米粒子具有大的比表面积，其光、热、磁敏感特性和表面稳定性较高。同时，纳米材料用于生物分析标记物质，可大大改善标记物的性能，显著提升现有分析方法的灵敏度及特异性，其在抗原抗体的标记上具有很大的应用潜能。纳米材料的引入为免疫层析技术实现高灵敏，高特异，快速检测奠定了良好的基础。采用侧流免疫层析技术对真菌毒素进行检测当中应用最为广泛的标记物是纳米粒子。

    用于毒素检测的纳米粒子标记物按材料可分为荧光纳米粒子、金纳米粒子以及磁性纳米粒子等。其中荧光纳米粒子又包括量子点及其量子点微球、荧光微球以及时间分辨荧光微球等；金纳米粒子包括常规胶体金及AgAu复合纳米粒子等。
    2.1 荧光标记免疫层析技术

    2.1.1 量子点层析技术

    量子点(Quantum dots，QDs)又称无机半导体纳米晶体，是一类由Ⅱ-Ⅵ族(如CdSe，CdTe，CdS，ZnSe等) 或Ⅲ-Ⅴ族(如InP，InAs等) 元素组成的纳米颗粒。量子点的粒径一般介于1～10nm之间，由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。其中，CdTe是最重要的纳米材料之一，常被用作生物标记探针。量子点作为一类理想的新型荧光探针，与传统的荧光染料相比，它具有宽的紫外线激发光谱和狭窄对称的荧光发射光谱；可精确调谐的发射波长；可忽略的光漂白等优越的荧光特性； 良好的光化学稳定性； 荧光寿命长，可接受多次激发等优越的荧光特性，因此，可以很好地应用于荧光标记。在免疫分析中应用是一个值得引起重视的新领域。

    由半导体材料构成的纳米荧光颗粒-量子点，因其具有更稳定、更强的荧光特性，并可以进行多信号的同时检测，已有研究者将其用于荧光免疫标记检测AFB₁及ZEN。Ren等制备了一种量子点微球免疫层析试纸条，用于快速检测玉米中AFB₁，线性范围为5～60pg/mL，检测荧光强度与AFB₁含量在该质量浓度范围内呈良好的线性关系，检出限为0.42pg/mL，检测时间为15min，与胶体金标记试纸条相比检出限低两个数量级。

    量子点探针用于层析法，既提高了灵敏度、特异性，又可实现快速、定量检测，在免疫层析中有广阔的应用前景和发展潜力。相比胶体金探针，量子点应用的报道较少，其研究刚刚起步，在制备、修饰及抗原抗体标记环节技术要求高，偶联结合物后的稳定性等方面有待进一步提高。

    2.1.2 基于时间分辨荧光免疫分析的层析技术

    时间分辨免疫层析快速检测技术(Time-resolved fluorescent immunochromatographic assay，TRFICA) 是集时间分辨荧光免疫分析技术和层析技术的优势，借助高灵敏的标记示踪物，用于微量物质检测的一种新兴技术。示踪物由两种不同镧系元素离子(分别作为光吸收子和发射子) 及陶瓷颗粒(作为主基质) 掺杂组成，优于免疫层析常用标记物胶体金，它具有较高的灵敏性，高稳定性，可通过时间分辨荧光免疫层析分析仪结合标准浓度曲线实现定量分析。

    张兆威等采用Eu3+包覆于硅胶形成的硅胶荧光微粒作为免疫标记物，将AFB₁抗体与乳胶铕进行偶联标记，建立AFB₁时间分辨荧光免疫层析快速检测法。与已有的胶体金免疫层析快速检测方法相比，该方法的灵敏度提高了1～2个数量级。该试纸条用于花生、稻米、植物油等农产品检测，检出限均为0.3μg/kg。相对误差小于10%，说明该试纸条可用于农产品中AFB₁快速检测。

    2.1.3 荧光微球免疫层析法

    荧光微球免疫层析技术是利用荧光微球表面修饰的羧基可共价结合抗体，通过该标记物发出稳定而强的荧光信号进行定量检测的新型检测技术。该标记物发光强度受激发光强度增强而增强，并且受外界影响小，已有用于毒素检测的研究。

    Liu等建立了基于荧光微球探针的免疫层析法，该法可用于快速筛查受AFB₁污染的酱油样品。所制试纸条的检测探针由荧光微球和抗AFB₁的抗体交联组成，该探针的光学特性消除了酱油样品的颜色干扰，可视检出限达到2.5μg/L，低于我国政府制定的限量标准(5μg/L) 。结果表明，荧光微球作为标记物的免疫层析技术在有色样品的检测中有较高的研究价值和前景。

    2.2 胶体金免疫层析技术

    2.2.1 胶体金免疫层析法

    免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。随着纳米技术的兴起和单克隆技术的发展，免疫胶体金技术成为继荧光素标记技术、放射性同位素标记技术和酶标记技术后发展起来的又一种固相标记免疫测定技术，已广泛用于医学临床诊断、动植物检疫、微生物检测、食品安全监督等领域。

    胶体金粒子对蛋白质具有较强吸附能力，可以与免疫球蛋白、毒素、酶、糖蛋白、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。同时，胶体金颗粒具高电子密度特性，即金标物在相应配体处大量聚集，肉眼可见红色或粉色斑点，因而，目前较多用于定性或半定量的快速免疫检测方法。胶体金免疫层析试纸条以其简便快速，成本低廉，结果直观，检测时间短，特异性强等优点，广泛用于AFs、OTA、FBs、DON等真菌毒素检测。并有商品化的试纸出售。

    2.2.2 复合纳米粒子(AgAu)标记免疫层析技术

    金包银纳米粒子可放大特异性抗原抗体的反应信号，增强胶体金的显色效果。Liao等制备了快速检测AFB₁的免疫层析试纸条。合成了AgAu复合纳米颗粒并用于AFB1抗体的标记，和金纳米颗粒标记抗体技术相比，试纸条灵敏度，重复性和稳定性都相应提高。其原理为利用复合纳米粒子标记特异性抗体，检测样品液中特异性抗原，应用免疫层析技术制备、组装成试纸条。所制备的试纸条的检出限为0.1ng/mL，检测时间为15min。该试纸条用于检测大米、小麦、向日葵、棉花、辣椒和杏仁中AFB₁，检测结果与ELISA检测结果一致。

    2.3 磁珠免疫层析技术

    磁珠免疫层析技术，它是将磁性纳米材料(Magnetic nanoparticle，MNs) 的磁信号与免疫层析技术相结合的技术。磁纳米探针通常由磁性元素(如Fe，Ni，Co)和它们的氧化物组成。该探针具有粒径小、比表面积大，穿透性强、可快速移动及超顺磁性、生物相容性、单分散性良好等特性，可在磁场下定位、富集和分离。此免疫标记物具有灵敏、快捷、高效、检测范围宽等优点，应用在免疫层析技术中使该技术向定量化、高灵敏度、多元化检测、层析系统集成化等方向发展。

    Tang等建立了一种快速检测食物中黄曲霉毒素B₂(AFB₂) 的免疫层析检测方法。AFB₂单克隆抗体的免疫标记物为磁纳米金微球(MnGMs)，这一微球以纳米Fe₂O₃颗粒为核，金标纳米颗粒为壳。将AFB₂抗原和羊抗鼠IgG 分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检出限和质控线。结果表明，该试纸条检出限为0.9ng/mL，相比金标免疫层析试纸条灵敏度提高3倍，并且15min内可得到定量检测结果。

    磁珠免疫层析技术是一项新兴检测技术，磁珠制备工艺及其敏感性，高特异结合等方面的进一步研究，将使该技术在毒素检测中有更好的应用前景。